Kepada editor

Spektrometri massa tandem (MS/MS) dinilai karena kemampuannya untuk memfasilitasi identifikasi molekuler dan memberikan data yang sangat konsisten di berbagai platform spektrometri massa. Yang berbeda dari MS/MS adalah fragmentasi yang terjadi selama ionisasi elektrospray (ESI), yang umumnya disebut sebagai fragmentasi dalam sumber (ISF) (Gambar 1 ). ISF pertama kali diamati pada tahun 1950-an dengan ionisasi elektron dan telah diakui sebagai fitur yang melekat namun sering diabaikan dari proses ESI, meskipun kurang lazim dibandingkan dengan ionisasi elektron. Baru-baru ini, ISF telah dikaitkan dengan representasi puncak yang berlebihan dalam data spektrometri massa kromatografi cair (LC/MS), di mana ia mencakup sebagian besar puncak yang tidak difilter yang diamati [ 1 ]. Karena kelebihan representasi dalam data LC/MS, dan ketidakmampuan selanjutnya untuk mengidentifikasi molekul yang terkait dengan puncak ini menggunakan data MS/MS, ISF telah dikaitkan dengan apa yang disebut “metabolom gelap” [ 2 , 3 ] (juga meliputi lipidom), istilah yang digunakan untuk menggambarkan spesies molekuler yang tidak berkarakterisasi dalam metabolomik dan lipidomik. Hubungan ini [ 1 ] ditentukan oleh pemeriksaan data MS/MS yang diperoleh pada energi tumbukan 0 eV dari pustaka luas METLIN yang berisi lebih dari 931.000 standar molekuler. Namun, sementara kesamaan ISF dan MS/MS pada data 0 eV telah dijelaskan dalam penelitian sebelumnya [ 1 , 4 – 6 ], belum secara langsung ditetapkan bahwa keduanya berkorelasi satu sama lain. Kami mengeksplorasi konsistensi antara data MS/MS (0 eV) dan ISF di berbagai spesies molekuler untuk menilai apakah penambangan data MS/MS (0 eV) METLIN—yang terdiri dari lebih dari 931.000 standar molekuler—dapat secara efektif menghubungkan ISF ke metabolom gelap dan lipidom.

GAMBAR 1
Buka di penampil gambar
Perbandingan spektrometri massa tandem ionisasi elektrospray (ESI) dan fragmentasi sumber (ISF) sebagai peristiwa terpisah dalam spektrometer massa. MS/MS dihasilkan dari peristiwa disosiasi akibat tumbukan (CID) antara dua penganalisis massa, sedangkan ISF terjadi di sumber ESI. Contoh data kromatogram ion terekstraksi (EIC) yang diperoleh dari glutamin dan EIC terkait dari enam kelompok sampel gnotobiotik yang berbeda. Konsistensi antara ion molekuler dan ISF sehubungan dengan intensitas ion relatif dan waktu retensi memberikan ciri khas ISF.
Kromatografi cair-spektrometri massa tandem (LC-MS/MS) dengan ESI telah menjadi landasan dalam metabolomik, lipidomik, dan analisis klinis karena akurasinya dalam mengidentifikasi molekul kecil dalam matriks biologis yang kompleks. Dengan LC-MS/MS, setelah ionisasi terjadi pada sumber ESI, molekul bermuatan diarahkan ke dalam sel tumbukan tempat mereka mengalami fragmentasi untuk analisis struktural. Prosedur ini biasanya diulang untuk semua analit bermuatan yang ada dalam sampel. Namun, terlepas dari kegunaannya, metode ini telah mengungkapkan serangkaian fitur spektral yang sangat luas yang terkait dengan “metabolom gelap”. Namun, mengingat jumlah gen pengkode protein yang terbatas [ 7 , 8 ] dengan hanya sebagian kecil yang menghasilkan enzim, keragaman kimia [ 3 , 9 , 10 ] yang dideteksi melalui LC-MS/MS—berpotensi ratusan ribu atau bahkan jutaan metabolit—jauh melebihi ekspektasi biologis. Perkiraan saat ini menunjukkan bahwa kurang dari 2% spektrum LC-MS/MS yang diamati dapat diberi anotasi, yang berpotensi menjadi spektrum luas senyawa yang tidak diketahui [ 3 ]. Penelitian terbaru [ 1 ] menggunakan database METLIN dan datanya pada 0 eV telah menjelaskan perbedaan ini, dan sebagian besar kompleksitas yang dirasakan mungkin berasal dari faktor teknologi, khususnya ISF, daripada dari keanekaragaman hayati itu sendiri.

Laboratorium kami, bersama dengan beberapa laboratorium lain [ 11 ], telah mengamati kejadian ISF yang meluas [ 12 , 13 ]. Proses ini melibatkan fragmentasi analit selama tahap ionisasi awal dalam sumber ESI, yang terjadi sebelum mencapai sel tumbukan. Pada dasarnya, ISF dapat mengubah analit tunggal menjadi beberapa ion dan fragmen molekuler, menciptakan susunan ion yang kompleks dari apa yang awalnya merupakan satu entitas. Akibatnya, penganalisis massa secara sembarangan mengisolasi dan selanjutnya memecah apa pun yang memasuki sel tumbukan. Mengingat pemahaman ini, kami menduga bahwa ISF mungkin memainkan peran penting dalam berkontribusi pada apa yang disebut metabolom gelap.

Bahasa Indonesia: Untuk mengkorelasikan pengamatan puncak dan ISF, kami memeriksa basis data METLIN MS/MS [ 14 ], yang terdiri dari lebih dari 931.000 standar molekuler yang mewakili lebih dari 350 kelas kimia tempat kami menambang data MS/MS METLIN pada 0 eV, energi yang dirancang untuk mensimulasikan tidak adanya CID. Analisis ini dilakukan untuk menilai apakah spektrum MS/MS yang diperoleh pada energi tumbukan 0 eV di METLIN dapat mencerminkan fragmen terkait ISF. Analisis mengungkapkan bahwa ISF dapat menjelaskan lebih dari 70% puncak yang diamati dalam kumpulan data metabolomik LC-MS/MS yang umum saat menggunakan ambang batas pemotongan 5%. Angka ini naik saat ambang batas dikurangi menjadi kurang dari 3%. Ambang batas 5% dan 3% mewakili rentang intensitas puncak yang konservatif di seluruh eksperimen LC/MS, di mana jumlah hitungan intensitas yang umum berkisar dari 10.000 hingga jutaan, lebih dari dua orde besaran.

Sementara studi METLIN menyediakan snapshot statistik yang besar dari jumlah puncak ISF dalam percobaan LC/MS yang khas, ia tidak memiliki contoh data yang secara langsung membandingkan kesamaan antara data ISF dan MS/MS (0 eV). Di sini, kami memeriksa kedua jenis data (METLIN MS/MS 0 eV dan ISF) dari 10 molekul (Gambar 2 dan 3 ). Data ISF diperoleh menggunakan spektrometer massa Agilent QTOF (sel tumbukan lepas) dan spektrometer massa Agilent TOF. Data tersebut mengungkapkan tingkat konsistensi yang tinggi antara METLIN MS/MS 0 eV dan ion fragmen yang dihasilkan ISF, meskipun intensitasnya secara umum lebih tinggi untuk puncak ion fragmen yang dihasilkan ISF. Contoh-contoh ini menunjukkan bahwa (1) perbandingan asli antara ISF dan MS/MS (0 eV) valid, dan (2) intensitas yang lebih tinggi yang diamati untuk fragmen ISF menunjukkan bahwa proses ISF sedikit lebih energik daripada MS/MS (0 eV), setidaknya dengan dua platform instrumen ini (Agilent QTOF dan Agilent TOF).

GAMBAR 2
Buka di penampil gambar
Perbandingan fragmentasi sumber ionisasi elektrospray (ESI) (ISF) dan spektrometri massa tandem pada energi tumbukan 0 eV metabolit/lipid endogen. ISF merupakan fenomena umum yang terjadi pada sumber ESI dan telah diteliti di sini pada berbagai standar molekuler metabolit dan lipid umum, termasuk serotonin, NAD, AMP, dan sphingosine. Analisis ini mengungkap konsistensi tinggi antara ISF dan spektrometri massa tandem (energi tumbukan 0 eV).

GAMBAR 3
Buka di penampil gambar
Perbandingan tambahan ISF dan MS/MS (0 eV) dari molekul nonbiologis, termasuk metabolit/turunan lipid umum yang dirancang untuk tujuan terapeutik. Ini termasuk 3-hidroksi asam miristat metil ester, 3,4-dimetoksifenetilamina, sulforafan N-asetil-L-sisteina, asam glisin-β-murikholik, 4-hidroksimefenitoin, dan 2′,5′-dideoksi adenosin.
Secara keseluruhan, contoh-contoh perbandingan antara data METLIN MS/MS (0 eV) dan ISF ini memberikan tingkat bukti lain bahwa puncak-puncak yang diamati dalam eksperimen LC/MS sebagian besar terkait dengan ISF. Gambar 4 juga menggambarkan penalaran konseptual di balik logika ini, di mana data MS/MS dihasilkan pada semua puncak LC/MS yang dapat diamati dan tidak difilter. Mengingat prevalensi ISF, sebagian besar data MS/MS tidak mewakili molekul nyata tetapi ion-ion fragmen. Ini akan menjelaskan mengapa begitu banyak puncak tidak dapat diidentifikasi dalam basis data spektrometri massa tandem saat ini.

GAMBAR 4
Buka di penampil gambar
ESI-ISF menciptakan representasi berlebihan dari puncak LC/MS yang menjadi sasaran analisis MS/MS. Data MS/MS yang dihasilkan dari ion fragmen ISF, dan ketidakmampuan untuk mengidentifikasinya, tampaknya menjadi penyebab utama “Dark Metabolome/Lipidome”.